Subprojeto 17 - Transgênese e microscopia intravital in Zebrafish: Expressão de miostatina

Participantes: Lucia Elvira Alvares, Carolina Stefano Mantovani (Mestranda) e Marina Alves Fontoura (Iniciação Científica)
IB – UNICAMP

A formação de diferentes tecidos e órgãos durante o desenvolvimento embrionário requer um refinado controle da expressão gênica. Atualmente, existem ferramentas valiosas, as quais possibilitam a observação da atividade gênica em embriões vivos ou fixados com a utilização demoléculas-repórter, em particular, proteínas fluorescentes. Um dos principais organismos-modelo utilizados nestes estudos é o peixe-zebra (zebrafish), um organismo vertebrado, cujos embriões são transparentes, numerosos e podem ser manipulados geneticamente com facilidade. Dentro deste contexto, a proposta deste projeto é utilizar o peixe-zebra como modelo experimental para desvendar os mecanismos que controlam a transcrição do gene que codifica a proteína Miostatina (Mstn). Para tanto, nós iremos estudar o papel de diferentes “regiões evolutivamente conservadas” (RECs), as quais foram localizadasno lócus gênico da Mstn de diferentes organismos vertebrados, por meio de análises de genômica comparativa. Dado o seu alto grau de conservação filogenética, as RECsidentificadas possivelmente atuam como elementos cis-reguladores da Mstn, controlando seus níveis de expressão, além de coordenar sua expressão espacial e temporalmente. Para confirmar esta hipótese, inicialmente diferentes RECsda Mstnserão clonadas no vetor de expressão pTKeGFP. Este vetor contém o promotor gênico da tirosina quinase(TK) dirigindo a transcrição do gene repórter eGFP (enhancedgreen fluorescente protein) e, por ser um promotor gênico fraco, o TK necessita do auxílio de regiões estimuladoras transcricionais (“enhancers”) para,em conjunto com estas, promover a transcrição em níveis que possibilitem a observação da proteína repórter em tecidos específicos do embrião. Assim sendo, após a preparação de um banco de construções de expressão distintas, contendo diferentes RECs no vetor pTKeGFP, serão gerados embriões transgênicos do peize-zebra por microinjeçãode DNA em embriões de uma ou duas células. Os embriões gerados serão mantidos em desenvolvimento até atingirem o estádio desejado para as análises de atividade do gene-repórter que, no caso do gene da Mstn, corresponde à fase em que começa haver a formação dos somitos. Desta forma, poderemos confirmar o papel das diferentes RECs no controle da transcrição da Mstn, estabelecendo quais delas coordenam a atividade do gene em órgãos/tecidos do embrião. O desenvolvimento desta pesquisa trará um avanço significativo no entendimento de como a atividade da Mstn é controlada na embriogênese e poderá gerar subsídios para o desenvolvimento de estratégias visando modular a transcrição da Mstn para fins terapêuticos ou de melhoramento animal.