Subprojeto 23 – Estudo da interação Rhodnius prolixus-Trypanosoma cruzi em tempo real, usando a pinça óptica e quantum dots visualizados por microscopia confocal

Participantes: Profa. Dra. Maria Denise Feder, do Departamento de Biologia da Universidade Federal Fluuminense, Dra. Suzete Araujo Oliveira Gomes do Núcleo de Morfologia e Ultraestrutura de Artrópodes, Laboratório de Transmissores de Leishmanioses- IOC-FIOCRUZ, Prof. Dr. Carlos Lenz Cesar do CEPOF e IFGW da UNICAMP. Essa colaboração já existe através de um projeto FAPERJ e CEPOF, alguns resultados já obtidos foram utilizados como parte da uma tese de mestrado do IFGW, gerou publicações em congressos e trabalhos submetidos e envolve a orientação de um mestrado no IOC – FIOCRUZ – RJ e co-orientação de dois doutorados no IFGW.

Neste projeto, estamos interessados em usar a pinça óptica e quantum dots como uma nova ferramenta no estudo da interação triatomíneos/tripanossomatídeos utilizando o Hemíptera-Reduviideo, R. prolixus como modelo, pois é o hospedeiro invertebrado do Trypanosoma cruzi/ Trypanosoma rangeli.Imagem de células vivas em tempo real é um dos maiores desafios para a biologia celular. Marcadores fluorescentes são poderosas ferramentas para visualizar processos celulares, porém, eles apresentam algumas limitações. Por exemplo, corantes orgânicos tendem a serem tóxicos para células. Green fluorescent proteins (GFP) são difíceis de manipular e apresentam um curto tempo de fluorescência. A nanopartícula semicondutora quantum dots (QDs) tem sido, pelas ultimas duas décadas, incorporados em uma ampla gama de aplicações de catálises e sensores ópticos a biomarcadores. Por esta razão, uma rota simples, barata e reproduzível de síntese é um dos principais objetivos de muitos grupos de pesquisa no mundo. Estes biomarcadores, Quantum Dots, possuem vantagens no estudo da biologia celular, através da sua eficiência em fluorescência e alta fotoestabilidade, sem alterar a integridade da célula. A pinça óptica é um instrumento que permite capturar e manipular partículas biológicas com tamanhos variando de décimos a centenas de micra, intra e extracelularmente, sem causar morte ou outros danos aos microorganismos estudados. Iremos neste projeto utilizar QD’s fluorescentes para o estudo in vitro e in vivo da interação Trypanosoma cruzi e o inseto triatomíneo Rhodnius prolixus, agente etiológico da doença de Chagas e seu hospedeiro invertebrado, respectivamente. A pinça óptica integrada em um microscópio confocal a laser nos permitirá manipular os parasitos, medir forças de adesão ao epitélio intestinal de seu vetor, bem como gravar vídeos com as imagens dessa interação. Um dos principais objetivos da Biologia é a compreensão da interação biomolecular entre as células. Estas interações são normalmente estudadas in vivo ou in vitro produzindo-se imagens com marcadores fluorescentes. Os marcadores fluorescentes orgânicos disponíveis no mercado, possuem efeito limitado. O semicondutor quantum dots (QDs) são nanocristais de Cádmio e Telúrio (CdTe) ou Cádmio e Selênio (CdSe) altamente luminescentes que podem ser usados para bioaplicação. QDs podem se ligar com moléculas de reconhecimento como as proteínas, peptídeos e ácidos nucléicos formando bioconjugados. Adicionalmente, os QDs apresentam propriedades vantajosas como: são mais brilhantes e mais estáveis que os fluoróforos orgânicos e não matam células, permitindo observação de biomoléculas no meio intra e extracelular. Bioconjugados de QDs tem sido amplamente aplicados para detecção de câncer de mama através do marcador Her2 em células fixadas; imagens de desenvolvimento de células vivas e alvos intracelulares como microtúbulos, filamentos de actina, núcleo e mitocôndria. O sucesso da aplicação dos QDs conjugados com biomoléculas na pesquisa médica sugere o potencial desta ferramenta nos estudos da interação parasito-vetor. A utilização de QD’s combinado com a Pinça óptica permite a obtenção de imagens de células vivas, capturadas ou não, bem como a observação das reações químicas em tempo real. O uso da pinça óptica, como ferramenta no estudo da interação irá permitir a captura destes parasitos e a sua análise sem alteração ou danos a esta célula, possibilitando o estudo e quantificação das forças de adesão destes parasitos a membrana do seu vetor e poderá permitir uma melhor compreensão dos fenômenos como: i) mobilidade flagelar dos parasitos; ii) adesão do parasito a membrana para indução da diferenciação; iii) medir a força de atração entre os parasitos para a formação de grumos no tubo digestivo do inseto. Com a utilização de uma tecnologia inovadora pretendemos com este estudo integrado, contribuir para a elucidação de mais alguns aspectos do ciclo biológico destes parasitos e os mecanismos de interação com o seu vetor invertebrado, elucidando pontos ainda obscuros. No estudo da Interação Triatomíneo/ tripanossomatídeos onde o triatomíneo usado nos ensaios será o Rhodnius prolixus e as cepas de T. cruzi (DM28c) e Trypanosoma rangeli (cepa H14), cujo processo de interação, já está bem descrito na literatura. A utilização de QD’s combinado com a Pinça óptica permite a obtenção de imagens de células vivas, capturadas ou não, bem como a observação das reações químicas em tempo real. Desta forma, os objetivos do presente projeto são: (1) Triatomíneo/ T.cruzi: A metaciclogênese tem lugar in situ, após torção e alongamento do corpo da forma epimastigota. Os mecanismos de adesão e de transformação dos epimastigotas de T. cruzi para tripomastigotas metacíclicos podem ser observados in vitro. Os epimastigotas em transformação aderem-se à superfície das células do epitélio intestinal do inseto antes de sua metaciclogênese. Pretendemos medir a intensidade da força envolvida na adesão do parasito através do flagelo nos diferentes compartimentos do tubo digestivo do inseto;(2) Triatomineo/ T rangeli- Estudos associados a fenômenos de mobilidade flagelar, adesão, dissociação e sensibilidade a estímulos do microambiente externo do parasito estão sendo investigados em estágios promastigotas de Leishmania amazonensis (comunicação pessoal, Dr. Carlos Lenz César). Este projeto também tem como objetivo estudar os aspectos, tal como os que estão sendo avaliados em L. amazonensis investigando os mecanismos característicos do ciclo biológico de Trypanosoma rangeli como (a) Utilizar a pinça ótica para medir o comprimento do corpo celular de formas epimastigotas curtas e longas de Trypanosoma rangeli; (b) Medir quantitativamente a força flagelar de epimastigotas de T rangeli (c) Medir a força de adesão e penetração entre a superfície dos parasitos e das células epiteliais do intestino médio e glândula salivar do triatomíneo; (d) Pa