Subprojeto 5 – Microendoscopia

Participantes: Cícero Omegna (Kom-Lux), Carlos Lenz Cesar (IFGW-Unicamp)

Existe um grande esforço internacional na área de microendoscopia com todas as técnicas de microscopias fotônicas porque elas permitirão a realização de estudos in-vivo. O idéia da microendoscopia é fazer com que o feixe de laser transmitido por uma fibra óptica, ou um cabo de fibras, faça uma varredura e usar a mesma fibra para coletar os sinais ópticos gerados na amostra. Os grandes desafios da microendoscopia de alta resolução são como fazer a varredura laser, como eliminar o “pinhole”, como aumentar a abertura numérica tanto da excitação quanto da coleta de luz e, se baseada na fluorescência, como marcar as células. Esse sub-projeto tem uma proposta para cada um desses desafios. Para evitar o uso do pinhole utilizaremos microscopias de óptica não linear, intrinsecamente confocais sem necessidade de pinhole. Microscopias SHG/THG e CARS não dependem de fluorescência e nem de marcadores exógenos, logo não existe o problema de marcar as células para observação in-vivo. Na microendoscopia se coletaria apenas a auto-fluorescência dos pigmentos mais comuns, que são triptofanos, indolaminas (incluindo seus dímeros e trímeros), fibrilinas, NADH, elastinas, lipofuscinas e flavinas. Destes, apenas as flavinas podem ser excitadas com comprimento de onda acima de 400 nm, ou seja, a excitação teria que ser na região do ultravioleta, em que a atenuação das fibras ópticas émuito alta. Entretanto, isso não representa um problema para microscopias multifótons porque a excitação através de 2, ou 3, fótons pode ser feita com lasers operando no infravermelho, região em que a atenuação das fibras ópticas é baixa. Se, por um lado, a utilização de microscopias não lineares, resolve os problemas do pinhole e da excitação no ultravioleta, por outro lado, ela abre um novo problema. As fibras ópticas tendem a alargar temporalmente os pulsos de luz devido a um fenômeno conhecido como dispersão de velocidade de grupo. Todo pulso é formado por várias componentes de diferentes comprimentos de ondas. Quando existe a dispersão de velocidade de grupo, cada uma dessas componentes se propaga com velocidades diferentes, o que alarga temporalmente o pulso. Um pulso que entra em uma fibra com 100 fs pode sair na outra ponta com dezenas de ps, o que diminui muito a eficiência dos processos multifótons. Existem fibras ópticas especiais, fotônicas, sem o efeito de GVD. Também existem técnicas para pré-compensar a GVD e garantir a duração temporal do pulso na saída da fibra. A proposta é utilizar ambos, fibras fotônicas e compensadores de dispersão de velocidade de grupo para resolver esse problema. Restaram dois desafios, ligados às propriedades das fibras ópticas. Como realizar a varredura e como conseguir altas aberturas numéricas. O desafio da varredura, é comum a todas as microendoscopias confocais. As propostas de varredura distal, na extremidade da fibra em contacto com a amostra, têm envolvido microespelhos baseados em MEMS [Micro-Electro-Mechanical Systems] ou rotação de micro-prismas ou fibras especiais. A necessidade de transportar energia elétrica ou mecânica até a saída do cabo de fibras tende a aumentar a dimensão do endoscópio. Por isso acreditamos que a varredura proximal, na extremidade oposta, é mais vantajosa. Para a varredura proximal o desafio é como transladar a varredura de uma ponta da fibra até a outra. Isso é feito muito facilmente em um cabo coerente de fibras ópticas, que podem conter mais de mil fibras. Essa será uma das nossas estratégias embora reconhecendo que a resolução lateral, definida pela distância entre as fibras ópticas no cabo, será baixa. Existem trabalhos mostrando que essa estratégia é possível com demonstrações de resoluções laterais de 2 a 3 microns, e axiais de 15 microns [E. Laemmela et al, J. Vasc. Res. 41, 400 (2004); F. Jean and G. Bourg-Heckly, Opt. Express, 15: 4008 (2007)]. Entretanto, os melhores resultados foram obtidos com a utilização de fibras óptics GRIN [GRaded-INdex Fiber]. Nas fibras GRIN o índice de refração é maior no centro do que na periferia, fazendo com que os raios se curvem para o centro como em uma lente. Utilizando um comprimento de fibra em que as duas extremidades correspondem a planos ópticos conjugados, uma varredura em uma das extremidades é transferida totalmente para a outra. Uma microlente na extremidade distal da fibra permite atingir altas aberturas numéricas. Utilizando microscopia de dois fótons em fibras GRIN a empresa alemã GRINTECH demonstrou microendoscópios com abertura numérica de 0,85 e resolução lateral de 500 nm e axial de 1.400 nm, com potencial para chegar a NA = 1,4. A proposta de desenvolvimento desse projeto é a seguinte. Modificar o cabo de fibras ópticas de um endoscópio incluindo uma fibra GRIN no seu centro. Usar o sistema de scanhead de um microscópio confocal, para fazer a varredura do feixe laser na extremidade distal da fibra GRIN. Dessa forma a varredura do feixe será transportada para a extremidade proximal, onde se encontra a amostra. Adaptar o sistema de iluminação do cabo para operar da forma convencional, iluminado com lâmpadas, ou através de varredura laser. A varredura será realizada no cabo como um todo para aquisição de imagens com menor resolução, ou apenas na região central, onde se encontra a fibra GRIN, para aquisição de imagens em alta resolução. Espera-se, ao final do projeto, o desenvolvimento de um acessório para microscopia confocal adaptável a qualquer marca e demonstrado a possibilidade de produção de um sistema completo de microendoscopia com as diversas microscopias biofotônicas. Esse protótipo deve ser, então, compartilhado com os membros da equipe desse projeto e a empresa Kom-Lux estudará a melhor forma de transformá-lo em um produto.