Subprojeto 20.1 – Estudo da miogênese no peixe-zebra

Participantes:Manoel Luis Costa
Instituto de Ciências Biomédicas – Universidade Federal do Rio de Janeiro

Estudamos in vivo e in situ o papel do citoesqueleto e adesão na diferenciação muscular, em embriões de peixe-zebra. As miofibrilas precisam desenvolver tensão enquanto estão sendo formadas, e sítios de adesão na membrana tem sido implicados na construção e alinhamento de estruturas precursoras da miofibrilas. Ao mesmo tempo, nos embriões, as células musculares nos somitos estão mudando de forma e se elongando, e os septos de matriz extracelular intersomitos são construídos. Logo em seguida, alguns mioblastos se fundem, o que novamente envolve adaptações de membrana e citoesqueleto. Pretendemos estudar o papel colesterol e dos microdomínios de membrana na miogênese in vivo. Já mostramos que a droga metil-beta-ciclodextrina (MCD), que retira colesterol da membrana e desorganiza seus microdomínios, perturba a miogênese in situ (Mermelstein CS et al 2005). Resolvemos estudar o colesterol na miogênese embrionária usando a droga sinvastatina, que bloqueia a síntese de colesterol. Nossos resultados mostram alterações fenotípicas profundas causadas pela sinvastatina. Também já mostramos que o colesterol atua na via de sinalização de Wnt na miogênese (Mermelstein CS et al 2007). Estamos estudando o papel dos microdomínios no peixe usando morfolinos contra a proteína reggie/flotilina, proteína estrutural dos microdomínios. Nossos resultados mostram alterações fenotípicas severas nos movimentos de gastrulação e na miogênese causadas pelo desligamento de reggie/flotilina.
Usando a metodologia de bloqueio por morfolinos que já dominamos, pretendemos interferir com a expressão de outras proteínas selecionadas por seu possível papel na miogênese. Para a seleção das proteínas, vamos usar dados gerados no estudo de transcriptoma de células em cultura tratadas com MCD, que acabamos de completar (Possidonio et al, 2014). Vamos fazer o acompanhamento in vivo da miogênese nos embrião mutantes com um microscópio confocal de disco, numa análise em 4 dimensões, usando microinjeção de vetores para expressão de proteínas fluorescentes ou linhagens transgênicas fluorescentes. Também pretendemos usar microscopia de super-resolução (SR-SIM). Nosso grupo é pioneiro no Brasil em microscopia óptica confocal de disco, e já publicamos vários artigos caracterizando a miogênese in situ no peixe-zebra (Costa ML et al 2002, Costa ML et al 2003, Costa ML et al 2008, Câmara-Pereira E et al 2009), além de outros modelos musculares (Soares et al 2012).