Subprojeto 17 – Metabolismo energético, estado redox e função mitocondrial em tumores cerebrais do tipo glioblastoma

Participantes: Roger Frigério Castilho
FCM – UNICAMP

Diversas desordens do sistema nervoso central (SNC) apresentam como etiologia alterações do metabolismo oxidativo mitocondrial associadas a mudanças no transporte de íons Ca2+, Na+, H+ ou K+, geração de espécies reativas de oxigênio ou apoptose regulada por fatores mitocondriais. Nosso Projeto visa melhor compreender a fisiopatologia do glioblastoma, um tumor astrocítico maligno, estudando a bioenergética mitocondrial e o balanço redox em células em cultura e em tecido tumoral de pacientes. Dentre os sistemas antioxidantes, especial atenção será dada à transidrogenase de nucleotídeos de adenina (NNT), enzima localizada na membrana mitocondrial interna, que promove a translocação de H+ para o interior da organela acoplada à transferência de um hidreto entre NADH e NADP+ na matriz mitocondrial. Os objetivos centrais de nosso Projeto incluem:
a) Estudar a bioenergética mitocondrial em células de glioblastoma humano em cultura (T98G e U87MG), correlacionando os resultados com a propriedade destas células de apresentarem metabolismo predominantemente glicolítico, mesmo na presença de oxigênio molecular (efeito Warburg). Pretendemos: i) Avaliar a ocorrência do efeito Warburg nas condições de cultivo celular utilizadas; ii) Determinar o acoplamento entre o consumo de oxigênio e a síntese de ATP em mitocôndrias de células de glioblastoma em suspensão; iii) Correlacionar a capacidade da fosforilação oxidativa das células de glioblastoma frente à atividade da cadeia respiratória; iv) Avaliar se nas condições de crescimento celular utilizadas ocorre restrição de substratos para o ciclo de Krebs; v) Determinar a p50 de O2 nas células T98G e U87MG em suspensão; vi) Avaliar o efeito da inibição da fosforilação oxidativa na citotoxicidade promovida pelo quimioterápico temozolamida nas células T98G e U87MG; vii) Verificar o impacto de inibidores da cadeia respiratória e da ATP sintase mitocondrial na viabilidade e proliferação das células T98G e U87MG; e viii) Verificar se células oriundas de material cirúrgico de humanos possuem as mesmas características bioenergéticas que as linhagens celulares estudadas (Comitê de Ética em Pesquisa da FCM-UNICAMP – Protocolo nº 1164/2011). Importância: Entender e correlacionar a bioenergética mitocondrial dessas células com a ocorrência do efeito Warburg poderá contribuir para a proposição de abordagens terapêuticas mais eficazes.
b) Avaliar o impacto do silenciamento da NNT na viabilidade e proliferação das células T98G e U87MG. Para relacionar estes resultados com o envolvimento da NNT na fisiopatologia de glioblastomas, estudaremos a expressão de NNT por imunoistoquímica em material cirúrgico de humanos. Importância: Uma possível correlação da expressão de NNT com a classificação dos gliomas como de alto e baixo grau de malignidade será estudada. No desenvolvimento deste projeto, estamos interessados em (1) Medidas de concentrações intracelulares de Ca2+ livre por microscopia confocal utilizando sondas fluorescentes específicas (p.ex. Fluo-4-AM e Rhod-2-AM); (2) Medidas da produção celular e mitocondrial de espécies reativas de oxigênio por microscopia confocal utilizando sondas fluorescentes específicas (p.ex. hidroetidina e MitoSOX) e (3) Avaliação de morte celular e autofagia por microscopia confocal utilizando marcadores fluorescentes.