Subprojeto 10.1 – Bioquímica in singulo

Participantes: Carlos Lenz Cesar; Prof. Hernandes F Carvalho; André Alexandre de Thomaz; Mariana OzelloBaratti,; Vitor BianchinPelegati
UNICAMP

O termo bioquímica in singulo [in singulobiochemistry], no sentido de observações de reações bioquímicas em uma única molécula [single moleculebiochemistry], foi criado pelo Professor de Berkeley Carlos Bustamante. A compreensão profunda dos processos básicos da vida vai depender do entendimento da bioquímica in singulo. Ao contrário da química convencional a heterogeneidade da biologia não permite inferir o comportamento das moléculas através da observação de ensembles de 1015 a 1023 moléculas. As reações bioquímicas no interior das células ocorrem em estruturas específicas de forma controlada com sinalização bioquímica. São reações controladas no tempo e no espaço, que dependem do meio,da difusão de moléculas como ATP e aminoácidos, da operação de motores moleculares, da mudança de conformação de enzimas, etc. A reação bioquímica ocorrer em algumas conformações mas não em outras. Como as mudanças conformacionais são, tipicamente, um processo estocástico, a reação bioquímica pode ocorrer em uma janela temporal muito curta. Isso significa que a observação de uma média temporal, mesmo em uma única molécula, se torna cega a eventos que ocorrem em tempos curto. Da mesma forma, médias no ensemble são cegas em relação a eventos que ocorrem emapenas uma fração muito pequena das moléculas. Em alguns casos os bioquímicos aprenderam a sincronizar diferentes moléculas para extrair informação mais precisa do ensemble, mas é consenso que o sistema perde a sincronização em um intervalo de tempo curto. A conclusão, portanto, é a de que a estratégia de inferir o que acontece nos processos celulares através de observações em grandes amostras não funciona bem na biologia celular, onde não existe uniformidade nem sincronismo dos processos.
A metodologia ideal para substituir as observações em ensembles tem que ser capaz de: (1) observar uma única molécula e (2) em intervalos de tempo tão curtos que permitam acompanhar as trajetórias temporais das moléculas. Esse tipo de observações experimentais considerada impossível na década de 1960 está se tornando comum no século XXI. Fluorescência, capaz de emitir 109 fótons/segundo, é uma das técnicas preferidas para observações in singulo. Dentro das técnicas de fluorescência existe todo um arsenal baseado no tempo de vida, na transferência de energia (FRET) e na espectroscopia de correlação (FCS), que trazem informações sobre as conformações moleculares e o ambiente químico da vizinhança molecular. O uso de pares doador-aceitador de fluoróforos em uma mesma molécula permite a utilização de FRET para observar a dinâmica molecular, como os motores moleculares, por exemplo. Além disso, muitas reações bioquímicas operam como máquinas mecânicas exercendo forças, caminhando ao longo de microtúbulos, etc. A replicação do DNA envolve a enzima DNA polimerase que se move a cada base copiada e puxa mecanicamente a fita de DNA. Isso significa que a caracterização biomecânica é fundamental nesses processos.
Duas técnicas têm obtido destaque nesse contexto: as pinças ópticas e a força atômica. Pinças ópticas podem exercer e medir forças no intervalo entre 50 femto-Newtons até 500 pico-Newtons e a força atômica opera tipicamente acima de 100 pico-Newtons até nano-Newtons. Ambas têm sido utilizadas para caracterizar mecanicamente reações bioquímicas in singulo. Finalmente, tip-enhancement permitiu a realização de espectroscopia em uma única molécula, como fluorescência ou Raman (TERS).Com essas técnicas é possível observar em uma única molécula processos de diferenciação e desdiferenciação, metilação, ações de micro-RNA, si-RNA ou lentivirus, detecção de proteínas, caracterização de metabolismo celular. No limite, as técnicas fotônicas permitirão estudos das ômicas, da genômica à metabolômica, em tempo real em uma única molécula, no interior de uma célula viva.
Metodologias:
Para estudos de moléculas isoladas usaremos várias estratégias. Uma delas é a da diluição, tanto em líquidos, quanto em superfícies, na qual deixamos uma solução secar. Mantendo as moléculas mais afastadas do que a distância de resolução por difração podemos estudar em paralelo as moléculas isoladas. A técnica de FCS é uma técnica de moléculas únicas mas com observação temporal restrita ao tempo de difusão da molécula pelo volume focal, da ordem de dezenas a centenas de s. Como FCS permite extrair o raio hidrodinâmico das moléculas podemos observar reações químicas in situ. Já utilizamos essa técnica no estudo de quantum dots. O maior desafio nesses estudos é evitar o photobleaching dos fluoróforos.
Por outro lado, ancorando a molécula em uma superfície podemos aumentar o tempo de observação e observar a dinâmica molecular. O problema de ancorar enzimas em superfícies específicas, de obter cópias de DNA em ambiente controlado, sem denaturação, disparar o processo de replicação de um DNA, ou de produção de proteínas, em uma câmara no microscópio, são exemplos de manipulações bioquímicas fundamentais para o desenvolvimento de estudos de bioquímica in singulo.Assim podemos acompanhar no tempo o comportamento de enzimas ancoradas e estudar a eficiência da síntese de proteínas em função das concentrações de ATP, pH, temperatura, força externa aplicada etc.O INFABIC é o local ideal para a realização desses estudos porque combina as competências em fotônica dos físicos com a bioquímica dos biólogos.
Metas mais específicas desse sub-projeto são:
Sequenciamento de um single strand DNA com alguma das seguintes técnicas: (1) utilizando marcadores fluorescentes diferentes para cada base observado com FLIM na presença do tip; (2) Utilização de um fluoróforo doador na DNA polimerase e observação do FRET com marcadores das bases.
Estudos de diferenciação e metilação de células trono em um único DNA single strand usando tip-enhancement. O objetivo final é obter não apenas a sequência das bases mas também definir quais citosinas estão metiladas.
Manipulação de DNA in singulo. O objetivo principal é demonstrar a possibilidade de metilação e des-metilação de parcelas do DNA usando reações fotoquímicas localizadas.
Transfecção de DNA em uma única célula usando pinças ópticas e laser cutting para demonstrar viabilidade de DNA manipulado e a possibilidade de reproduzir manipulações à posteriori. Conferir o sucesso/insucesso do procedimento de transfecção via estudos de time-lapse.
Estudos complementares:
Estudo da geração de segundo e terceiro harmônicos nas vizinhanças do tip metálico incluindo seu perfil espacial através da posição do tipo relativa à nanopartículas fluorescentes.
Estudo de fotoreações na região nanometricamente próxima do tip iluminado por feixes de luz de femto-segundos.