Subprojeto 1 – Câncer e Metástase

Participantes: Fátima Aparecida Bottcher, Liliana Andrade, Marianne Pinotti, José Aristodemo Pinotti, Carlos Lenz Cesar, João Ernesto de Carvalho (Coordenador da Divisão de Farmacologia e Toxicologia – Centro Pluridisciplinar de Pesquisas Quimícas, Biológicas e Agrícolas). Mary Ann Foglio (Coordenadora da Divisão de Fitoquímica do CPQBA). Essa colaboração já se iniciou e envolve uma bolsa de pos-doutorado da FAPESP em co-orientação entre os Profs. Lenz e Bottcher.

Este projeto tem como objetivo utilizar técnicas de microscopias biofotônicas: SHG, Multifóton, Pinças Ópticas e CARS, como sistema de estudo de processos celulares fundamentais para as células tumorais, representados pela interação célula-célula e, dentro deste, a habilidade de produzir metástases loco-regionais e à distância (outros tecidos). Os estudos se concentrarão nas áreas de câncer de mama e ovário. A mortalidade pelo câncer do ovário é a mais alta entre os cânceres ginecológicos, relacionada principalmente ao estádio avançado da doença ao diagnóstico. A falta de um método de triagem para lesões precursoras do câncer de ovário é um fato conhecido e contribui para esta alta mortalidade. A busca de novos métodos diagnósticos que possam melhor reconhecer estas lesões iniciais e conseqüentemente auxiliar no diagnóstico precoce é sempre um desafio e um estímulo aos estudos nesta área. Em uma primeira etapa, faremos a aquisição de imagens com as diversas técnicas biofotônicas de uma biblioteca de lâminas de patologia já existentes, visando comparar as imagens obtidas com os aspectos morfológicos clássicos destas neoplasias. Pretende-se ainda verificar a existência de novos padrões que possam reconhecer os diferentes grupos das neoplasias, através destas novas técnicas. Nos últimos dez anos a Divisão de Farmacologia e Toxicologia (DFT) do CPQBA tem trabalhado na busca de novas drogas anti Câncer. Para isso, o DFT mantém cultura provenientes de diversos tipos de tumores sobre as quais princípios ativos extraídos de plantas da flora brasileira. Serão investigadas as seguintes situações: tecido não neoplásico, carcinomas in situ, borderline e invasivos. Atenção especial será dada à matriz de colágeno, obtido com SHG. A comparação das imagens convencionais com as biofotônicas deverão mostrar onde as últimas fornecem mais informação do que existia e indicar as técnicas a serem utilizadas nos estudos de células cultivadas. O banco de lâminas de câncer de ovário corresponde à linha de pesquisa já existente (“Participação das proteínas caderina E e N, cateninas alfa e beta e galectina-3 no processo de metástase ovariana (*), aprovado pelo CEP da FCM/Unicamp, com o qual os trabalhos podem ser iniciados imediatamente. Através da técnica de imunoistoquímica, realizada em um dos estudos do grupo, observou-se o papel da galectina-3 como marcador diferencial de neoplasias malignas e benignas de ovário, sob diferentes scores analisados (dados não divulgados). Dados da literatura sugerem fortemente que a galectina-3 atua como um dos disparadores de angiogênese na aquisição de potencial metastático, fato que é o atual objeto de estudo do grupo de pesquisa. A outra etapa do projeto é o estudo de células e linhagens cultivadas. Para tanto, serão utilizadas células de mama, não neoplásicas e tumorais, obtidas a partir de cultivos primários e de linhagens estabelecidas. Nestas, serão feitas medidas de elasticidade em várias situações, especialmente no contato célula-célula. As células serão mantidas em placa NUNC para cultivo celular, em sistema aberto, estufa a 37°C e 5% CO2. Todos os ensaios serão realizados a partir das células em monocamada, em confluência a 70%. Os repiques serão feitos com auxílio de cell scraper, de modo a não introduzir alterações significativas na superfície e membrana celulares. As células advindas de cultivo primário serão primeiramente mantidas em meio Ham’s F12, acrescido de 20% de soro fetal bovino. Após os repiques, as linhagens serão mantidas no mesmo meio de cultura, porém com soro fetal a 10%. Não serão utilizados fatores de crescimento adicionais àqueles existentes no soro fetal. A concentração de antibióticos será triplicada, durante a realização dos ensaios de microscopia, devido ao risco de contaminação das amostras.Todos os ensaios serão realizados em triplicatas. Serão utilizadas amostras representantes dos seguintes tecidos: (1) mama não neoplásica (advinda de mamoplastias estéticas redutoras) e linhagem MCF-10 (2) mama tumoral – linhagem MCF-7 (baixo potencial metastático e receptor de estrógeno posistivo) biópsias provenintes de tumores in situ, invasivos e metastáticos.
- linhagem MDA-MB435 (alto potencial metastático). Além desses, as seguintes linhagens são cultuvidas no CBPQA, e serão estudadas: OVCAR (ováRIO), NCI ADR (ovário resistente), PCO 3 (prostata), HT 29 (colon), NCI 460 (pulmao), 786 0 (rim), UACC (melanoma) e k562 (LEUCEMIA). A pinça óptica colocará as células tumorais em contato com diferentes monocamadas de células hospedeiras (linhagens de célula adiposas, hepáticas e nervosas), sendo registrados os eventos nos seguintes tempos de observação: – 30 minutos – 1 hora – 2 horas – 3 horas- 12 horas- 24 horas- 48 horas. Serão realizadas, para cada monocamada sob teste, as medidas de elasticidade e viscosidade, e a aquisição de imagens através das técnicas de CARS, SHG, Multifóton e FLIM, tendo como foco principal observar as diferenças de comportamento das células correspondentes às diversas fases da neoplasia maligna da mama, comparando-as com o comportamento das linhagens imortais estabelecidas. Serão estudados ainda o comportamento das células tumorais comparados ao das células não neoplásicas de modo isolado, isto é, sem qualquer contato com células de outros tecidos. Cabe salientar que a literatura é escassa no que corresponde aos eventos iniciais da carcinogênese mamária, daí a importância do estudo de células não neoplásicas e dos tumores in situ, cujo material é de difícil obtenção nos serviços públicos especializados. Neste sentido, o CEP da clínica EGIMAJAP aprovou o projeto de pesquisa referente ao “Cultivo primário de células da mama” e, tendo em vista a relevância do estudo, terá 2 profissionais para dar suporte às questões de ordem clínica (Professor Pinotti e Dra. Marianne Pinotti), além de fornecer o material biológico para o estudo em questão. A clínica financiará, ainda, parte dos reagentes a serem utilizados no estudo, visando a imortalização de células obtidas a partir do cultivo primário. A clínica EGIMAJAP aprovou o projeto de pesquisa “Participação das células tronco na carcinogênese dos tumores triplo-negativos da mama”, utilizando as técnicas de CARS, SHG e multifóton e visando investigar o novo paradigma sobre a carcinogênese mamária, o seja, a participação das células tronco nos tumores mamários commente refratários a tratamento de primeira e segunda linha (triplo negativos para receptores de estrógeno, progesterona e c-erb-B). Finalmente, as novas ferramentas de microscopia disponibilizadas por esse projeto possibilitarão estudar os mecanismos de ação dos princípios ativos no CBPQA cujos objetivos específicos são (1) Avaliar a atividade anticâncer em cultura de células tumorais humanas (in vitro) de extratos, frações e princípios ativos obtidos de fontes naturais, síntese e semi-síntese; (2) Selecionar as substâncias com melhor perfil de atividade in vitro para determinação do tipo de morte produzido; (3) Com base no perfil de atividade in vitro, no tipo de morte celular e na disponibilidade de quantidades adequadas das substâncias ativas, avaliar a atividade em modelos experimentais de câncer murino: tumor sólido de Ehrlich e Melanoma B16F10.